菌種保藏的基本操作方法

菌種在生命活動、菌種繁育時，由于受外界不良條件、病毒的傷害，往往會發(fā)生退化。如高溫會使菌絲生命力降低；傳代次數(shù)增加，會使某些細胞器減少甚至丟失；接種時菌種常會受到消du要劑和火焰高溫的傷害而發(fā)生退化；接種挑選菌種時可能在無意中造成某一形態(tài)的菌絲比例多，而另一形態(tài)的菌絲減少；傳代，繁殖菌種很可能被病毒侵染。如此種種情況，都會使菌種發(fā)生退化。保種可降低發(fā)生變異的頻率。保種另一層意義是，保藏某一菌種的某些特殊遺傳性狀（遺傳基因），這此性狀對生產(chǎn)可能無經(jīng)濟使用價值，但以后或才可作為育種材料。

1.定期移植法 

將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上﹐在適合溫度中培養(yǎng)﹐至靜止期或產(chǎn)生成熟的孢子時﹐置入 5℃的冰箱(或冰庫)保存。在培養(yǎng)和保存的過程中﹐由于代謝產(chǎn)物的累積而改變了原菌的生活條件﹐結(jié)果菌落群體中的個體就不斷衰老和死亡﹐因此每5~15天或 1~4個月重新移植一次﹐具體間隔時間因種而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設(shè)備﹐但煩瑣﹐費時﹐而且經(jīng)常移植容易引起菌種退化。 

2.礦油封藏法 

將化學(xué)純的液體石蠟(礦油)經(jīng)高壓蒸氣滅菌﹐放在40℃恒溫箱中蒸發(fā)其中的水分﹐然后注入斜面培養(yǎng)物中﹐使液面高出斜面約 1厘米。將試管直立﹐放在15~20℃室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體﹐既能隔絕空氣﹐又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥﹐可以延長菌種保藏的時間。但注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶﹑對菌種無毒﹐不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌﹑芽孢桿菌﹔不適用于固氮菌﹑乳酸桿菌﹑明串珠菌﹑法門氏菌和毛霉目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行﹐但必須注意防火和污染。 

3.沙土管法 

將沙或土過篩﹑烘干﹑裝管﹑滅菌﹑然后將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分﹐干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態(tài)﹐可保存較長時期。此法適用于芽孢桿菌﹑梭狀芽孢桿菌﹑放線菌﹑鐮刀菌等。 

4.麩皮法 

將麩皮制成培養(yǎng)基﹐培養(yǎng)要保存的菌種﹐待生長良好后﹐置干燥器中保存。這是根據(jù)中國釀造酒﹑醋﹑醬時制曲的經(jīng)驗所采用的一種保藏方法﹐適用于谷物微生物區(qū)系中的種類。 

5.L-干燥法 

又稱液體干燥法或真空干燥法﹐用含3%谷氨酸鈉的0.1M磷酸緩沖溶液 (pH7.0)做分散媒﹐將待保藏的微生物制成高濃度的細胞懸液﹐滴入無菌安瓿瓶中﹐每管0.05毫升﹔將安瓿瓶固定在多歧管上﹐并以水浴保持安瓿瓶內(nèi)樣品溫度為10℃﹐在 13.3~1.3帕的真空度下干燥﹐火焰封管保存。此法不經(jīng)凍結(jié)﹐用真實泵迅速抽乾﹐可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應(yīng)用于病毒﹑噬菌體﹑細菌﹑酵母菌﹑藍藻﹑原生動物等。 

6.梭氏法 

將容有1滴細胞懸液的小管﹐置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中﹐用真空泵抽至1.3帕?xí)r﹐將大試管密封保存。這是為減少細胞死亡率而采取的一種不經(jīng)凍結(jié)﹑緩慢脫水的干燥保藏法﹐適用于多種細菌﹑真菌。 

7.冷凍真空干燥法 

將細胞懸液每0.1~0.2毫升注入一無菌安瓿瓶﹐于-40℃預(yù)凍1小時﹐再于-20~30℃﹑真空度為13.3帕的條件下脫水。在脫水過程后期﹐安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水后的樣品含水量應(yīng)在 3%以下。將安瓿瓶保持真空度 1.3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。為防止細胞在凍結(jié)和脫水過程中損傷或死亡﹐要用保護劑制備細胞懸液。保護劑有脫脂牛奶﹑血清﹑10%蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通過氧和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細胞成分的構(gòu)型。此法適用于病毒﹑衣原體﹑枝原體﹑細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌等的保存﹐是當前保藏菌種的一個重要方法。但是﹐鹽桿菌﹑發(fā)光桿菌﹑黏桿菌﹑阿舒囊霉﹑多囊霉﹑擔(dān)子菌中的大多數(shù)屬種不適用于此法保存。