RT-qPCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR) 實(shí)驗(yàn)手冊(cè)

在RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，RNA提取完成后，需要對(duì)RNA的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，合格后才可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。評(píng)估方法有分光光度計(jì)，瓊脂糖凝膠電泳，Agilent 2100分析等，其中常用的有分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)。我們需要注意的是這兩種方法需要搭配使用，才能完成對(duì)RNA濃度、純度和完整度的檢測(cè)分析，以保證RNA的質(zhì)量。

分光光度計(jì)：

分光光度計(jì)主要用于測(cè)定RNA的濃度和純度，但不能對(duì)RNA的完整度和基因組殘留進(jìn)行檢測(cè)。其中，A260/280和A260/230是RNA純度檢測(cè)的重要參數(shù)，可根據(jù)其數(shù)值的波動(dòng)，檢測(cè)RNA的純度：
1、1.9< A260/280< 2.1，說(shuō)明RNA純度較好；A260/280<1.9，表示RNA中可能有蛋白殘留；A260/280>2.1，表示RNA可能有部分降解，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn)。
2、2.0< A260/230< 2.2，說(shuō)明RNA純度較好；A260/230< 2.0，則說(shuō)明RNA中可能有機(jī)試劑殘留，如酚、乙醇或糖類等。

瓊脂糖凝膠電泳：

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可以分析RNA的完整度，基因組和蛋白殘留，但不能對(duì)RNA的濃度準(zhǔn)確定量，也不能檢測(cè)有機(jī)試劑的殘留。以真核生物RNA模板為例：
1、 將RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若膠圖上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶，說(shuō)明提取的RNA完整度良好。如果出現(xiàn)拖帶的現(xiàn)象，表示RNA部分降解。
2、若膠孔和28sRNA條帶之間出現(xiàn)單一明亮的條帶，表示可能有基因組DNA殘留。
3、若膠孔內(nèi)出現(xiàn)條帶，說(shuō)明可能有蛋白等大分子物質(zhì)殘留。


逆轉(zhuǎn)錄
RNA提取完成后，需要反轉(zhuǎn)成cDNA才能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以反轉(zhuǎn)步驟是*的。逆轉(zhuǎn)錄將從逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇和引物的選擇進(jìn)行介紹：

逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇：

常見(jiàn)代表性反轉(zhuǎn)錄酶有AMV RTase和MMLV RTase兩大類：AMV RTase的RNase H活性強(qiáng)，合成長(zhǎng)度短，合成量低，熱穩(wěn)定性好（42～55℃）；MMLV RTase的RNase H活性弱，合成長(zhǎng)度長(zhǎng)，合成量高，熱穩(wěn)定性差（37～42℃）。
由于RNase H酶具有降解RNA模板的功能，所以在逆轉(zhuǎn)錄時(shí)應(yīng)該優(yōu)先選擇RNase H活性弱的MMLV ，而且后期經(jīng)過(guò)基因工程改造，MMLV熱穩(wěn)定性已達(dá)到質(zhì)的飛躍。以Yeasen的Hifair Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶（11141）為例，該酶經(jīng)基因工程改造，刪除了RNase H活性，同時(shí)反應(yīng)溫度可達(dá)60℃，針對(duì)高GC及富含復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板具有更高的反轉(zhuǎn)錄效率。

引物的選擇：

通常RT primer可分為三類：oligo dT，隨機(jī)引物和基因特異性引物。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求選擇適合的引物進(jìn)行使用。

1、如果模板為真核生物來(lái)源，且后期cDNA用于常規(guī)PCR擴(kuò)增，建議選擇Oligo（dT）；若后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅用于qPCR，建議將Oligo（dT）與隨機(jī)引物混合后使用，可提高反轉(zhuǎn)錄效率。
2、如果模板為原核生物來(lái)源，反轉(zhuǎn)錄請(qǐng)選用Random Primers 或者基因特異性引物。

熒光定量

熒光定量主要從定量方法的選擇、引物設(shè)計(jì)原則、ROX的選擇、反應(yīng)體系的配置和反應(yīng)條件的設(shè)置等分別進(jìn)行闡述：

定量方法的選擇：

定量方法分為相對(duì)定量和定量。相對(duì)定量可用于檢測(cè)某種處理方法對(duì)基因表達(dá)的影響，檢測(cè)基因在不同時(shí)間的表達(dá)差異和比較基因在不同組織中的表達(dá)差異；定量可對(duì)病毒中核酸的量進(jìn)行檢測(cè)等。大家在做實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)選擇合適的定量方法。

引物設(shè)計(jì)原則：

qPCR引物設(shè)計(jì)的好壞，直接關(guān)乎著擴(kuò)增效率高低，產(chǎn)物特異性與否。所以正確設(shè)計(jì)出好的引物是qPCR成功的第1步。引物設(shè)計(jì)在滿足常規(guī)引物設(shè)計(jì)的原則上還要注意以下原則：
1、 目的片段長(zhǎng)度控制在100 ~ 300 bp；
2、跨外顯子設(shè)計(jì)，避免基因組DNA的影響；
3、 設(shè)計(jì)的引物需要進(jìn)行擴(kuò)增效率的檢測(cè)，擴(kuò)增效率達(dá)標(biāo)（90-110%）才可用于定量實(shí)驗(yàn)；
4、 引物濃度通常在0.1uM-1.0uM之間優(yōu)化選擇。

ROX的選擇：

在定量反應(yīng)過(guò)程中，ROX能夠均一化校正儀器的光程差，移液誤差或蒸發(fā)冷凝導(dǎo)致的體積差等，提高結(jié)果的重復(fù)性。但需要注意的是ROX的選擇與儀器相關(guān)，如果qPCR儀有自動(dòng)校正孔間差的功能，就不需要添加ROX，反之則需要添加ROX校正。小伙伴們?cè)谫I(mǎi)試劑時(shí)一定要根據(jù)所用的儀器型號(hào)選擇正確ROX，避免后期出錯(cuò)。

反應(yīng)體系的配制：

反應(yīng)體積優(yōu)先推薦20ul和50ul。體系配制時(shí)要注意以下事項(xiàng)：
1、 反應(yīng)體系需要在超凈工作臺(tái)中通風(fēng)配制；每次實(shí)驗(yàn)都要用新的ddH2O；
2、每次實(shí)驗(yàn)都需要配制NTC來(lái)驗(yàn)證體系中是否存在污染，配制體系時(shí)每一對(duì)引物都需要做NTC；
3、如果想檢測(cè)RNA模板是否有g(shù)DNA殘留，可將每個(gè)樣本都配制NRT進(jìn)行檢測(cè)；
4、配制體系時(shí)，一個(gè)樣本建議至少做3個(gè)技術(shù)型重復(fù)；
5、模板為cDNA時(shí)，建議稀釋5-10倍，減少反轉(zhuǎn)錄體系對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)的抑制作用，模板量需要進(jìn)行梯度摸索，使CT值落在20-30之間；
6、確定所需的反應(yīng)數(shù)量，在反應(yīng)數(shù)量的基礎(chǔ)上增加5-10%，計(jì)算體積配置數(shù)量；
7、體系配制采用能預(yù)混則預(yù)混原則，混勻后離心并保證無(wú)氣泡；
8、盡量選擇進(jìn)口且配套的耗材，如ABI儀器要使用ABI封板膜，伯樂(lè)儀器使用配套的白色陶瓷板子