Western Blotting實驗檢測注意這幾點

1、收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

可以使用適當?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提。

收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用北京博奧森生物技術公司生產(chǎn)的WIP細胞裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒。

2、電泳(Electrophoresis)

（1）、SDS-PAGE凝膠配制

SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。

（2）、樣品處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制，也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) 。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

（3）、上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預染蛋白質(zhì)分子量標準。

實驗注意事項

1、 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；

a. 轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡

b. 在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡

c. 將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極

d. 將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠

e. 按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移

f. 轉(zhuǎn)移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠

2、 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現(xiàn)時取出，記錄下標準位置；

3、 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液；

4、 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時；

5、 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜

6、 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣；

7、 袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊；