苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF使用小技巧

苯甲脒類(lèi)物質(zhì)是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑，所以將這類(lèi)物質(zhì)偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠4FF上，可以從各種來(lái)源的樣品中一步純化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽釋放酶、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。

苯甲脒-瓊脂糖凝膠 4FF 對(duì)于不同的樣品的親和力不同，吸附載量取決于流速、pH、緩沖液組成和溫度等參數(shù)。

（1）讓所有的材料和試劑達(dá)到室溫。配制初始緩沖液（平衡液）和洗脫緩沖液。

（2）根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠，用去離子水清洗掉 20%乙醇，用初始緩沖液（按凝膠：緩沖液=3：1 的比例）配成勻漿。

（3）將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤(rùn)濕并保持一小段液位，務(wù)必使底端無(wú)氣泡。

（4）用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi)，注意勿使產(chǎn)生氣泡。打開(kāi)柱子出液口，使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，連結(jié)好柱子頂端柱頭。

（5）打開(kāi)蠕動(dòng)泵，讓緩沖液用使用時(shí)流速的 1.33 倍的流速流過(guò)，使柱床穩(wěn)定（注意壓力不要超過(guò)填

樣品應(yīng)*溶解，并且pH值應(yīng)與結(jié)合緩沖液pH值相同。

為了避免堵塞層析柱，我們建議通過(guò)0.45μ m過(guò)濾器進(jìn)行離心和過(guò)濾，以去除細(xì)胞碎片或其他顆粒物質(zhì)。

平衡色譜柱

用5-10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡該柱，直到流出液電導(dǎo)和pH不變。 參考結(jié)合緩沖液：0.05M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH 7.4。

上樣

（1）樣品用平衡液配制，樣品一定要離心或過(guò)濾后上樣。鹽濃度太大的樣品需要處理后再配。

（2）一般情況是讓目標(biāo)產(chǎn)品結(jié)合在柱子上，用平衡液洗去雜質(zhì)和沒(méi)有結(jié)合的蛋白，再選擇一種洗脫洗下目標(biāo)產(chǎn)品