支原體試劑盒使用注意事項(xiàng)


本試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測(cè)支原體污染。這種染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可將其染色而被檢測(cè)到。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞周?chē)煽吹皆S多大小均的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA染色斑，說(shuō)明有支原體污染。Hoechst 33258的大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。

操作步驟：

貼壁細(xì)胞：

1.被檢細(xì)胞接種于無(wú)菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×104。同時(shí)，接種正常無(wú)支原體感染的同種細(xì)胞，作為陰性對(duì)照。

2.5天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入1ml的固定液，靜置20min，

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置15-20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml滅菌超純水洗滌三次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周?chē)欠裼兴{(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。

懸浮細(xì)胞：

1.收集需檢測(cè)的細(xì)胞，1500rpm，5min。

2.將收集的細(xì)胞涂片于載玻片上，再加1ml的固定液，靜置20min。

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置15～20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，用無(wú)菌水洗滌玻片3次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周?chē)欠裼兴{(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。

注意事項(xiàng)：

1.Hoechst工作液對(duì)人體有害，請(qǐng)注意防護(hù)。

2.固定液有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行固定。

3.支原體檢測(cè)時(shí)，好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3代，這樣容易避免假陰性結(jié)果。

4.本試劑盒用于6孔板檢測(cè)時(shí)，可以進(jìn)行50次檢測(cè)反應(yīng)。

5.檢測(cè)支原體污染，可以使用支原體高效Vero細(xì)胞，這樣可以提高檢測(cè)靈敏度，即將被檢測(cè)樣品接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。