組織細(xì)胞蛋白提取

描述：從組織細(xì)胞中提取總蛋白是 Western Blot 的關(guān)鍵步驟。實(shí)體軟組織如腦脊髓富含磷脂，神經(jīng)xue管含大量結(jié)締組織，而脂肪則含有大量油脂，常規(guī)的方法難以有效從這些組織中提取蛋白。本試劑盒為組織或培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取提供完整的解決方案。用裂解-結(jié)合緩沖液勻漿裂解實(shí)體組織，或直接用裂解-結(jié)合緩沖液重懸培養(yǎng)細(xì)胞，然后加入抽提試劑去除非蛋白成分，離心、干燥后即可得到總蛋白。蛋白沉淀溶解后用常規(guī)方法進(jìn)行蛋白定量。提取過(guò)程可在 30-60 分鐘內(nèi)完成，可在 1.5mL 離心管微量提取也可大規(guī)模制備，極為簡(jiǎn)便高效。

規(guī)格： 50次  100次

儲(chǔ)存：室溫或4ºC   24個(gè)月有效

操作步驟：

固體組織蛋白提取

1.         每 10-100mg 固體組織剪碎后加入 0.5-1 mL 裂解液，放入玻璃勻漿器內(nèi)上下手動(dòng)勻漿 15 次；或用高速機(jī)械勻漿器 12,000 rpm破碎組織。少量小的未破碎組織不影響后續(xù)抽提。注意：肝腎脾組織蛋白含量高，提取時(shí)應(yīng)加較少量的組織，一般不超過(guò)50 mg，否則形成的蛋白膜厚、致密且難溶。

2.         僅取 0.5mL 組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管，棄去剩余的組織勻漿液。每 0.5mL 組織勻漿液加入2倍體積的(1mL)抽提試劑充分混勻。室溫或 4ºC 靜置 10 分鐘，偶爾晃動(dòng)。注意：(1)如組織量<10mg，在下一步離心時(shí)形成的蛋白膜易碎，靜置 30min 有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪組織時(shí)應(yīng) 4ºC 靜置 40min 以上以充分去除油脂。(3) 0.5mL 組織勻漿液獲得的蛋白足以進(jìn)行幾十次 Western Blot。保證每 0.5mL 組織勻漿液加入 2 倍體積的(1 mL)抽提試劑是成功的關(guān)鍵。

3.         10,000 × g 4ºC 離心 10 分鐘，溶液分為上下兩相，兩相中間為蛋白膜。吸除上層液體；隨后用吸頭或針頭輕輕撥開(kāi)蛋白膜，吸除下層液體。蛋白膜將附著于離心管壁。注意：(1)離心速度過(guò)高將使蛋白膜過(guò)于堅(jiān)固，難以溶解。(2)如果不 能分相，可再加入 50μl 蒸餾水混勻離心。 (3)如果初始組織量較少(<10mg)，離心后難以得到完整的蛋白膜，此時(shí)可吸

3.去上下層液體，加入 1mL 純乙醇混勻，10,000 × g 4ºC 離心 3 分鐘。棄所有液體，蛋白沉淀在管底。

4.         敞開(kāi)管口，室溫空氣干燥沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分，可 4ºC 或－20ºC 一年以上。

說(shuō)明

1.         按照上述提取和溶解過(guò)程，不加蛋白酶抑制劑，而蛋白不會(huì)有明顯降解，用戶不必(但可以)加入蛋白酶抑制劑。

2.         蛋白定量。注意使 SDS 濃度稀釋到不影響蛋白定量的水平，或選擇不受 SDS 影響的 BCA 定量方法。BCA 法<5% SDS濃度，Bradford 法<0.125% SDS 濃度。

3.         按比例可進(jìn)行大規(guī)模的(多至1 g) 組織蛋白提取。

培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取 (參見(jiàn)固體組織蛋白提取程序中的斜體字注解)

1.         消化洗滌并 800 g 離心收集細(xì)胞。每 5-10 × 10⁶ 細(xì)胞加入 0.5 mL 裂解液，振蕩重懸，4ºC 凈置 2 分鐘。

2.         按比例每 0.5 mL 裂解液加入 1 mL 抽提試劑，振蕩混勻。4ºC 靜置 10min。

3.         10,000g 4ºC 離心 10 分鐘，溶液分為兩相，兩相中間為蛋白膜。小心吸除上層相和大部分下層相，保留兩相中間的蛋白絮狀物。如果不能分相，可再加入 50μl 蒸餾水混勻離心。

4.         加入 1 mL 純乙醇洗滌沉淀。10,000g 4ºC 離心 3 分鐘，蛋白沉淀在管底。

5.         去除管中所有液體，敞開(kāi)管口，室溫空氣干燥蛋白沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分，可4ºC或－20ºC 一年以上。